| 产品简介

本化学发光检测利用辣根过氧化物酶（HRP）催化底物反应，产生可见光信号。该反应基于HRP催化过氧化氢氧化鲁米诺（Luminol），氧化态鲁米诺在衰变至基态时释放光子。此方法兼具显色法检测的速度与安全性，同时具有更高的灵敏度。

LifeSuper ECL 超敏发光液专为Western Blot、Dot/Slot/Spot Blot等应用设计，适用于PVDF膜和硝酸纤维素（NC）膜，与常用缓冲液及封闭试剂兼容。PVDF膜上的印迹可剥离再生，支持同一张膜多次检测不同靶蛋白。

本产品由Luminol试剂和过氧化物溶液组成，使用时等体积混合即为工作液。该发光液可产生高信号强度与低背景，适用于高丰度及低丰度蛋白的检测。

| 产品组成

保存条件：2–8 °C避光保存。

产品简介：

本化学发光检测利用辣根过氧化物酶（HRP）催化底物反应，产生可见光信号。该反应基于HRP催化过氧化氢氧化鲁米诺（Luminol），氧化态鲁米诺在衰变至基态时释放光子。此方法兼具显色法检测的速度与安全性，同时具有更高的灵敏度。

LifeSuper ECL 超敏发光液专为Western Blot、Dot/Slot/Spot Blot等应用设计，适用于PVDF膜和硝酸纤维素（NC）膜，与常用缓冲液及封闭试剂兼容。PVDF膜上的印迹可剥离再生，支持同一张膜多次检测不同靶蛋白。

本产品由Luminol试剂和过氧化物溶液组成，使用时等体积混合即为工作液。该发光液可产生高信号强度与低背景，适用于高丰度及低丰度蛋白的检测。

| 使用建议

1. 抗体稀释：由于本产品灵敏度高，建议减少抗原上样量并提高抗体稀释度。

一抗常用稀释比为 1:1,000–1:20,000；二抗常用稀释比为 1:20,000–1:200,000。若从低灵敏度底物切换至本产品，一抗稀释度通常需增加至少5倍，二抗增加2–5倍，以获得最佳信噪比。

2. 封闭优化：封闭试剂及孵育时间的优化应通过预实验确定。

3. 曝光时间：因灵敏度高，X射线胶片曝光时间可能显著缩短。建议初始曝光时间为30秒，后续根据信号强度调整。

4. 操作规范：全程佩戴手套，使用钝头镊子取膜，避免污染与膜损伤。

5. 禁忌：所有缓冲液及试剂中不得使用叠氮钠（NaN₃），因其会抑制HRP活性。

6. 抗体稀释液：使用封闭液稀释抗体可进一步降低背景并提高灵敏度。

| 自备材料

蛋白转膜所需：

• PVDF膜（0.45 µm或0.2 µm）或硝酸纤维素膜

• 转印滤纸（与凝胶尺寸匹配）

• 100%甲醇（PVDF膜预湿用）

• 电转印系统及转印缓冲液

• 超纯水（建议使用新鲜制备的超纯水）

免疫检测所需：

• 洗涤液：PBS或TBS，含0.05–0.1% Tween-20

  - PBS：10 mM磷酸钠，150 mM NaCl，pH 7.2

  - TBS：10 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4

• 封闭液：1–5%（w/v）封闭剂（如酪蛋白、BSA或脱脂奶粉）溶于洗涤液

  注：2%酪蛋白溶液可获得最低背景及最高信噪比。

• 目标蛋白特异性一抗（用洗涤液或封闭液稀释）

• HRP标记二抗（对应一抗宿主来源，用洗涤液或封闭液稀释）

• 浅底孵育盘

• 保鲜膜/塑封袋/透明片夹

• X射线胶片及显影定影试剂，或化学发光成像系统

| 使用建议

1. 抗体稀释：由于本产品灵敏度高，建议减少抗原上样量并提高抗体稀释度。

一抗常用稀释比为 1:1,000–1:20,000；二抗常用稀释比为 1:20,000–1:200,000。若从低灵敏度底物切换至本产品，一抗稀释度通常需增加至少5倍，二抗增加2–5倍，以获得最佳信噪比。

2. 封闭优化：封闭试剂及孵育时间的优化应通过预实验确定。

3. 曝光时间：因灵敏度高，X射线胶片曝光时间可能显著缩短。建议初始曝光时间为30秒，后续根据信号强度调整。

4. 操作规范：全程佩戴手套，使用钝头镊子取膜，避免污染与膜损伤。

5. 禁忌：所有缓冲液及试剂中不得使用叠氮钠（NaN₃），因其会抑制HRP活性。

6. 抗体稀释液：使用封闭液稀释抗体可进一步降低背景并提高灵敏度。

| Western Blotting 实验流程

A. 蛋白转膜

1. 将蛋白样品通过SDS-PAGE分离。

2. 将凝胶浸入转印缓冲液平衡10–15分钟。

3. PVDF膜处理：

将膜浸入100%甲醇中15秒，直至膜由不透明变为半透明；NC膜无需甲醇预湿，直接进入步骤4。

4. 将膜在转印缓冲液中平衡至少5分钟。

5. 滤纸在转印缓冲液中浸泡至少30秒。

6. 按"海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵"顺序组装转印三明治，逐层用干净吸管或玻璃棒轻轻滚动，彻底排除气泡。

7. 按电转印仪厂商推荐条件进行转膜。

8. 转膜结束后取出膜，用超纯水短暂冲洗以去除凝胶碎屑。PVDF膜可吹干后置2–8 °C保存数月。

B. 抗体孵育

1. 再水化：若PVDF膜已干燥，用100%甲醇浸泡15秒使其恢复半透明，NC膜跳过此步。

2. 用超纯水漂洗后，将膜浸入封闭液，室温轻摇孵育1小时。

3. 按"使用建议"推荐比例稀释一抗。

4. 将膜置于一抗工作液中，室温轻摇孵育至少1小时，确保液体可自由覆盖膜表面。

5. 洗涤：新鲜洗涤液洗膜，每次5–10分钟，至少3次。增加洗涤次数或时间可进一步降低背景（0.2 µm PVDF膜因表面积大，建议增加洗涤）。

6. 按比例稀释HRP标记二抗。

7. 将膜置于二抗工作液中，室温轻摇孵育1小时。

8. 同步骤5，用新鲜洗涤液洗膜至少3次，每次5–10分钟。

C. 化学发光检测

1. 工作液配制：等体积混合Luminol试剂与过氧化物溶液。用量约为 0.1 mL/cm² 膜面积。常用规格参考：

2. 将工作液恢复至室温（约10分钟），无需避光。

3. 将膜蛋白面朝上置于洁净容器中，加入工作液覆盖膜表面。

4. 室温孵育5分钟。

5. 倾去多余工作液。

6. 用保鲜膜或片夹覆盖膜，排除气泡，确保表面干燥平整。

7. 置于X射线胶片或化学发光成像系统中曝光。建议初始曝光30秒。发光信号可持续至少2小时，必要时可补加新鲜工作液进行连续曝光。

注：配制好的工作液建议当天使用，避免活性损失。

| 膜再生/剥离（仅限PVDF膜）

同一张PVDF膜可通过剥离去除已结合抗体，再封闭后检测其他靶蛋白。剥离过程通过去污剂/加热或低pH处理破坏抗原-抗体结合。具体剥离方案请参考相关技术手册。

注意：剥离后必须重新封闭膜，方可进行下一轮抗体孵育。